Amélioration des traitements de FIV par imagerie des spermatozoïdes

Pourquoi avez-vous choisi de rechercher les spermatozoïdes et la FIV?

Ma carrière universitaire a été fortement orientée vers la recherche de nouvelles modalités d'imagerie microscopique optique 3D, pourtant très pragmatiques pour les applications biomédicales, avec un accent sur l'imagerie 3D sans taches des cellules biologiques in vitro.

Parmi les différents domaines d'application de ces technologies, la FIV est très importante où l'on souhaite obtenir "beaucoup plus" d'informations sur les cellules observées, tout en minimisant les dommages à ces cellules.

À titre de comparaison, en pathologie typique, vous êtes libre d'utiliser des produits chimiques de coloration sur l'échantillon biologique, car après l'analyse, l'échantillon est soit jeté, soit archivé, mais n'est jamais réutilisé dans le corps humain.

FIV

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Qu'est-ce que la FIV?

Dans sa définition plus étroite (et plus précise), la FIV conventionnelle (fécondation in vitro) est une procédure où l'ovule femelle est placé à l'intérieur d'une boîte de Pétri avec une grande population de spermatozoïdes et d'un milieu de support, et la fécondation de l'ovule par un des spermatozoïdes devrait avoir lieu.

Le type de FIV le plus avancé et le plus répandu est connu sous le nom d'ICSI (injection intracytoplasmique de spermatozoïdes), car certaines études ont montré une plus grande chance de fécondation lors de la sélection et de l'injection directes d'un seul spermatozoïde dans l'ovule. Ces procédures relèvent du domaine général de l'ART (technologies de reproduction artificielle).

Comment avez-vous développé une méthode d'imagerie 3D sûre et précise pour surveiller le mouvement et la qualité des spermatozoïdes?

Nous avons développé des configurations holographiques cliniques qui peuvent visualiser des cellules biologiques individuelles sans coloration avec un grand contraste, et obtenir beaucoup plus d'informations que possible avec une coloration régulière (ce qui n'est pas autorisé en FIV ou ICSI).

L'holographie utilise l'interférence optique d'un faisceau d'échantillon avec un faisceau de référence pour enregistrer le retard de la lumière passant à travers l'échantillon, et ainsi elle produit un contraste quantitatif sans étiquette dans l'image.

De cette façon, nous enregistrons le front d'onde de l'échantillon complet contenant la carte d'épaisseur optique, ou la carte OPD (retard de chemin optique) de la cellule, de sorte qu'à chaque point sur cette carte, OPD est égal à l'intégrale des valeurs d'indice de réfraction à travers le épaisseur des cellules.

Nous avons utilisé un faisceau lumineux très faible pour éviter d'endommager le matériel génétique.

La figure ci-dessous présente des images de spermatozoïdes acquises dans mon laboratoire, qui démontrent les différences entre les informations qualitatives fournies par la microscopie à fond clair (BFM), même si l'utilisation de l'étiquetage ou de la coloration pour améliorer le contraste, la microscopie à contraste d'interférence différentielle (DIC), qui est l'une des techniques d'imagerie de phase qualitative les plus couramment utilisées, et l'holographie, ou microscopie en phase interférométrique (IPM), qui permet des mesures quantitatives de l'épaisseur optique de la cellule sur tous ses points.

Les valeurs sur la carte topographique OPD sont proportionnelles à la densité de surface de la masse sèche de la cellule imagée, qui est un exemple d'un paramètre cellulaire qui n'a pas été disponible pour les cliniciens jusqu'à présent.

Imagerie des mêmes spermatozoïdes avec des méthodes de microscopie qualitative typiques et avec IPM quantitative (holographie), fournissant une carte OPD topographique, telle qu'obtenue dans mon groupe. La barre de couleur à droite représente les valeurs OPD en nm, pour l'image holographique. BFM = microscopie à fond clair. DIC = contraste d'interférence différentiel, IPM = microscopie en phase interférométrique (holographie).

L'holographie, en général, est basée sur une technologie mature de détection de front d'onde. Cependant, jusqu'à récemment, il ne pouvait pas être mis en œuvre dans les cliniques en raison de son encombrement, de sa non-portabilité et de la nécessité de compétences optiques spécifiques pour l'aligner et l'utiliser.

Au cours des dernières années, nous avons fait des efforts importants et réussi à rendre ces capteurs de front d'onde abordables pour une utilisation clinique directe.

Nous utilisons des modules compacts et portables qui peuvent être connectés aux microscopes de laboratoire existants et fournir des données holographiques de la même qualité, voire meilleure, par rapport à celles fournies par les configurations beaucoup plus volumineuses et coûteuses.

En effet, en utilisant ces configurations, nous avons montré que les configurations holographiques prêtes pour la clinique peuvent représenter des spermatozoïdes avec un excellent contraste sans coloration, possédant le potentiel de détecter la fragmentation de l'ADN dans les spermatozoïdes sans coloration, ainsi que de les colorer virtuellement, ce qui signifie montrer les cellules comme ils étaient colorés chimiquement (article récent du PNAS).

L'holographie ne fournit qu'une carte OPD topographique. Il n'a pas de capacité de coupe intracellulaire et il ne peut pas fournir l'image 3D x – y – z.

Pour permettre la visualisation de l'image 3D complète, la tomographie interférométrique est utilisée, où de nombreuses projections holographiques sous plusieurs angles sont collectées et traitées pour générer la carte d'indice de réfraction 3D.

Pour permettre la collecte de projections holographiques pour plusieurs angles de vision, il existe deux approches: faire pivoter l'échantillon entier ou balayer l'éclairage.

Cependant, aucune de ces méthodes ne peut faire face au problème d'obtenir une imagerie 3D sans étiquette à haute résolution de cellules dynamiques ultra-rapides, comme les spermatozoïdes nageant librement depuis la rotation de l'échantillon ou l'illumination prend du temps.

Dans notre récent article Science Advances, nous avons présenté la première tomographie interférométrique haute résolution pour l'acquisition 3D de l'ensemble du spermatozoïde (tête avec organites et queue) pendant la nage libre et sans coloration cellulaire.

Nous avons obtenu à la fois le profil d'indice de réfraction 3D de la tête du sperme, révélant ses organites internes fins et son orientation variant dans le temps, ainsi que la localisation détaillée en 4D (espace et temps) de la queue mince et hautement dynamique du spermatozoïde.

La tomographie de la tête de sperme est basée sur le fait que le sperme tourne sa tête naturellement pendant la nage libre, ce qui nous donne une possibilité "libre" d'enregistrer ses projections holographiques. Cette méthode a un grand potentiel pour les tests biologiques et l'utilisation clinique des spermatozoïdes intacts car elle fournit une imagerie 3D dynamique (ou 4D).

Voir les figures ci-dessous.

Image de sperme 4D: acquisition 3D d'un spermatozoïde pendant la nage libre sans coloration.
Taux d'acquisition: 2000 images de seconde, Durée: une demi-seconde.

Visualisation des organites internes du spermatozoïde, qui peuvent être discriminés par les valeurs de leur indice de réfraction (RI). Cela se fait pendant la nage des spermatozoïdes et sans les tacher.

Quels sont les avantages de votre nouvelle méthode d'imagerie par rapport aux autres techniques d'imagerie précédemment utilisées en FIV?

En ce qui concerne nos techniques holographiques habituelles, l'OMS (Organisation mondiale de la santé) et la communauté clinique et scientifique de la médecine de la reproduction ont caractérisé la structure interne des «bons» spermatozoïdes de façon assez précise; pour être en mesure d'évaluer si les spermatozoïdes satisfont à ces critères, il faudrait colorer chimiquement les cellules et, par là, les rendre impropres à une utilisation en FIV.

Notre technique holographique permet à l'embryologiste d'avoir toutes les informations nécessaires à l'application des critères de l'OMS, ainsi que des informations beaucoup plus pertinentes sur les spermatozoïdes individuels observés, tels que le niveau de fragmentation de l'ADN.

Maintenant, nous sommes encore mieux que cela, car notre approche tomographique fournit une acquisition complète de la dynamique 3D du sperme (et pas seulement une projection holographique). L'analyse peut être effectuée manuellement par l'embryologiste ou automatiquement par l'ordinateur.

Depuis que les images 4D des spermatozoïdes, qui sont choisies pour la fécondation, sont désormais enregistrées (contrairement à la pratique courante aujourd'hui), et elles contiennent de nombreux nouveaux paramètres, tels que les volumes d'organes de sperme et sa dynamique 3D complète, une base de données de spermatozoïdes les cellules peuvent être construites, analysées par apprentissage profond, puis utilisées pour étudier les raisons de réussite / d'échec du couple, ce qui établit un nouvel outil de médecine personnalisé.

Pourquoi est-il important que le test d'imagerie soit sûr pour une utilisation sur les spermatozoïdes?

Il existe des directives réglementaires très strictes sur la sécurité des gamètes (c'est-à-dire les ovules et les spermatozoïdes) qui sont destinés à être utilisés pour créer in vitro embryons, comme il est clair, ceux-ci se transformeraient, espérons-le, en bébés.

Pourquoi la coloration des spermatozoïdes n'est-elle pas autorisée en FIV?

Il existe différents types de taches, mais la coloration peut avoir besoin de «tuer» le spermatozoïde, en cassant sa membrane externe pour la pénétrer (c'est-à-dire la pénétrer) avec l'agent d'étiquetage particulier et se lier en interne à la molécule cible, qui peut être une protéine dans le noyau, l'acrosome, le cytoplasme, etc.

En outre, les procédures de FIV humaine ne permettent généralement pas d'utiliser même des colorants fluorescents pour les spermatozoïdes vivants en raison du risque d'endommager le matériel génétique des spermatozoïdes.

Pourquoi la qualité du sperme est-elle si importante dans les traitements de FIV?

Une meilleure sélection des spermatozoïdes se traduira par de meilleurs taux de grossesse et de meilleurs résultats. Les résultats cliniques se situent à une naissance vivante sur environ six cycles de FIV.

En règle générale, tous les ovules sont fécondés par les spermatozoïdes dans un traitement de FIV moyen en raison de leur petit nombre (une dizaine d'ovules), mais la sélection individuelle de spermatozoïdes sur des millions est au cœur d'un traitement de FIV moyen et a un traitement médical, financier, émotionnel, impact social et professionnel sur les couples qui essaient de devenir parents. Chaque spermatozoïde entraîne une personne différente si la grossesse réussit.

On pense que le sperme très individuel qui pourrait éventuellement féconder l'ovule a un rôle tout aussi important dans la détermination du sort de la grossesse que celui de l'ovule. Une culture d'embryon typique de 3 ou 5 jours ne permettrait qu'un aperçu partiel de la «qualité» globale de l'embryon et de ses chances de donner naissance à un enfant vivant.

Il existe, en effet, des techniques relativement nouvelles qui sont utilisées en remplacement de l'amniocentèse, qui est généralement appelée PGD ou PGS, mais elles seraient surtout adéquates pour essayer d'identifier des traits génétiques spécifiques, de sorte que ces développements ne concurrencent pas mais complètent plutôt chacun autre.

De plus, nous ne voulons pas faire face à une situation dans laquelle tous les ovocytes d'un cycle de FIV sont fécondés par des spermatozoïdes défectueux.

ICSI

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Comment cette méthode contribuera-t-elle à améliorer les futurs traitements de FIV?

Nous pensons que, tout comme n'importe quel embryologiste aujourd'hui utiliserait son microscope standard pour examiner la façon dont un spermatozoïde candidat nage ou est généralement façonné, dans un avenir pas trop lointain, nous verrions de nombreux embryologistes appliquer un dépistage complet des spermatozoïdes candidats avant individuellement les injecter dans les œufs récupérés.

Plus loin, nous avons l'intention de générer une base de données complète d'images 3D sans taches sur les spermatozoïdes, ainsi que des images d'embryons et des informations sur les résultats cliniques, et en utilisant des méthodologies d'apprentissage approfondi, ouvrir la voie à la prochaine génération d'intelligence artificielle big data. sélection des spermatozoïdes.

Croyez-vous que votre technique d'imagerie pourrait aider à diagnostiquer les problèmes de fertilité masculine?

Un couple sur six souffre de problèmes de fertilité. On pense que 1/3 de tous les cas d'infertilité sont dus uniquement au facteur masculin, 1/3 uniquement aux facteurs féminins, et les 1/3 restants sont combinés.

L'évaluation clinique de la présence du cas dans l'un de ces groupes est généralement effectuée à la suite de quelques tests cliniques et de laboratoire de routine effectués avec le couple, y compris l'analyse du sperme.

Notre technique est basée sur une imagerie unique et directe sans taches de spermatozoïdes avec un poste de travail de niveau clinique.

Dans notre étude, nous avons cherché à développer un type de technologie d'imagerie entièrement nouveau qui fournirait autant d'informations que possible sur les spermatozoïdes et permettrait la sélection de spermatozoïdes optimaux dans les traitements de fertilisation. Comme expliqué ci-dessus, nous avons choisi la tomographie holographique.

En utilisant notre technique, nous pensons qu'un test rapide, bon marché et simple peut soit affirmer, soit nier ces explications potentielles de l'infertilité.

Dans notre article sur la fertilité et la stérilité, nous avons montré que nous pouvons faire aussi bien que le protocole de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) pour les cellules de coloration, mais sans coloration. Et c'était juste en utilisant une seule projection holographique.

J'ai co-fondé, avec le PDG Alon Shalev, une société nommée QART Medical, qui devrait introduire cette technologie dans les cliniques au cours des 2 prochaines années. Au sein de l'entreprise, nous avons construit plusieurs machines d'imagerie clinique du sperme, et nous prévoyons commencer bientôt des essais cliniques.

Maintenant, nous sommes encore meilleurs car nous avons une méthode d'imagerie 3D très rapide pour tout le sperme (tête et queue), sans coloration. Nous pouvons donc relier la dynamique 3D du sperme à sa morphologie et comprendre les mécanismes de sélection du sperme dans le corps de la femme.

Quelles sont les prochaines étapes de votre recherche?

Nous avons construit plusieurs prototypes de travail dans mon laboratoire pour l'imagerie holographique en milieu clinique, imagé des milliers de spermatozoïdes, les analysé et effectué divers tests par des embryologistes cliniques expérimentés, pour notre validation de la technique (voir les publications ci-dessous).

Nous voulons être en mesure d'apporter cette technologie aux cliniques dès que possible, ce qui permettra de l'utiliser pour la FIV humaine et l'ICSI.

En utilisant notre récente technique d'imagerie 4D, je prévois d'étudier les comportements dynamiques des spermatozoïdes dans divers scénarios, afin de construire un modèle biophysique et biomécanique unifié qui relie la morphologie, le mouvement et le contenu 3D du sperme.

Je prévois également de vérifier toutes les capacités de notre nouvelle technique d'imagerie 4D sans taches pour détecter divers détails morphologiques qui n'ont pas pu être détectés jusqu'à présent pendant la FIV et l'ICSI et de quantifier leur importance clinique, ainsi que de vérifier notre capacité technique dans la mesure de l'ADN niveau de fragmentation des spermatozoïdes.

Où les lecteurs peuvent-ils trouver plus d'informations?

Groupe de recherche: www.eng.tau.ac.il/~omni

Compagnie: www.qart-medical.com

Articles scientifiques pertinents spécifiques:

  • G. Dardikman-Yoffe, S. K. Mirsky, I. Barnea et N. T. Shaked, «Acquisition 4-D haute résolution de spermatozoïdes humains nageant librement sans coloration», Science Advances, vol. 6, n ° 15, eaay7619, 2020 (PDF, Supp Mat, Vidéo 1, Vidéo 2, Vidéo 3, Vidéo 4, Vidéo 5) (Lien).
  • YN Nygate, M. Levi, SK Mirsky, NA Turko, M. Rubin, I. Barnea, G. Dardikman-Yoffe, M. Haifler, A. Shalev et NT Shaked, «Coloration virtuelle holographique de cellules biologiques individuelles», Actes de la National Academy of Sciences USA (PNAS), 2020 (PDF) (Lien).
  • M. Haifler, P. Girshovitz, G. Band, G. Dardikman, I. Madjar et N. T. Shaked, «Microscopie en phase interférométrique pour l'évaluation morphologique sans étiquette des spermatozoïdes», Fertility and Sterility, Vol. 104, numéro 1, pp. 43-47, 2015 (Vue).
  • I. Barnea, L. Karako, S. K. Mirsky, M. Levi, M. Balberg et N. T. Shaked, «Corrélation de microscopie en phase interférométrique sans taches avec la coloration de fragmentation de l'ADN dans les spermatozoïdes humains», Journal of Biophotonics, Vol. 11, e201800137, pp.1-10, 2018 (Lien).
  • P. Jacob Eravuchira, S. K. Mirsky, I. Barnea, M. Levi, M. Balberg et N. T. Shaked, «Sélection individuelle de spermatozoïdes par microfluidique intégrée à la microscopie en phase interférométrique», Methods, Vol. 136, p. 152-159, 2018 (Lien).
  • S. K. Mirsky, I. Barnea, M. Levi, H. Greenspan et N. T. Shaked, «Analyse automatisée des spermatozoïdes individuels en utilisant la microscopie en phase interférométrique sans taches et l'apprentissage automatique», Cytometry Part A, Vol. 91, numéro 9, p. 893-900, 2017 (Lien).
  • M. Balberg, M. Levi, K. Kalinowski, I. Barnea, S. Mirsky et N. T. Shaked, «Mesures localisées des paramètres physiques dans les spermatozoïdes humains obtenus par interférométrie à large champ», Journal of Biophotonics, Vol. 10, numéro 10, 1305-1314, 2017 (Lien).

À propos du professeur Natan Shaked

Le professeur Natan T. Shaked est professeur agrégé titulaire et directeur du groupe de recherche sur la microscopie optique, la nanoscopie et l'interférométrie biomédicale (OMNI) (www.eng.ac.il/~omni), un grand groupe de recherche qui fait partie du Département de génie biomédical et du Nano Center de l'Université de Tel Aviv, Tel Aviv, Israël.

Situé sur trois espaces de laboratoire, le groupe effectue des recherches multidisciplinaires impliquant l'imagerie optique et la détection dans les systèmes biologiques. Jusqu'en avril 2011, le professeur Shaked était professeur adjoint invité au département de génie biomédical de la Duke University, Durham, Caroline du Nord, États-Unis.Professeur Natan Shaked

Shaked a BSc, MSc et Ph.D. diplômes en génie électrique et informatique. Le professeur Shaked est le co-auteur de plus de 80 articles de revues à comité de lecture et 150 articles de conférence, plusieurs chapitres de livres, des brevets et un livre édité.

Il préside la conférence annuelle SPIE Label-Free Imaging and Sensing (LBIS) à SPIE Photonics West, San Francisco, États-Unis, et co-fondateur de QART Medical Ltd (www.qart-medical.com). Le professeur Shaked a remporté de nombreuses bourses de recherche prestigieuses, dont la subvention personnelle HORIZON2020 ERC, qui a financé cette recherche.